无缝克隆（同源重组）技术以简单、快速、高效等特点深受小伙伴们的喜欢！但也有部分小伙伴在进行长片段连接的时候遇到了涂板不长克隆的情况，或者连接没有问题但是同源臂两端出现位点突变等奇怪现象。聚合美帮你一一排除这些雷，你会发现搞定长片段克隆并不难！
多片段无缝克隆连接原理示意图
一 如何提高长片段的连接效率？
短片段无缝克隆实验很容易就成功，而长片段无缝克隆比较麻烦。
长片段的扩增比较难，需要用扩增能力强的超保真酶来做，我们推荐聚合美的“长又亮”Neo超保真酶（货号MF947），它特有的PCR Buffer，让聚合美特制的延伸增强剂和抗GC抑制剂能够得到充分的溶解，使其功能最大化，对长片段有非常好的扩增能力。
其次，扩增得到片段后，一定要做胶回收（推荐MF029），跑电泳确定条带的浓度，而不仅仅是靠OD值。最后，算好片段和载体的摩尔比，找到最恰当的使用浓度和体积。
比较长片段与短片段、单片段与多片段克隆，同样的操作，同样的试剂，唯一不同的就是体系内目的片段和载体的数量，也就是摩尔数。为了提高连接效率，我们必须提高目的片段和载体的密度，使得载体和目的片段在反应体系内“邂逅”并“相爱”的机会更多，连接效率就更高！使用这种方法高难度的长片段拼接也变得轻而易举！
赛事回顾
据此原理，聚合美专门为长片段和高难度片段连接设计了5x高浓度mix（货号：MF018-plus），是您解决长片段连接的终极神器。一经推出就得到了市场的强烈反响。
MF018-plus比其他品牌对比图（感谢NIBS客户提供）
2xSM为T品牌2x无缝克隆mix
CK（诺）为国产V品牌5x无缝克隆mix
5xSM为聚合美5x无缝克隆mix
二 如何避免无缝克隆连接成功却引入同源臂附近突变？
无缝克隆mix市面上很多，但做得精效率高的却不多。最大的原因是该mix组分多，稍微质控不慎就会影响效率；其次，mix最核心组分是超保真酶，某些品牌虽然能生产无缝克隆mix，但是其超保真酶技术并不过关，导致出现克隆连接成功，但测序后发现同源臂附近偶尔有突变，影响后续表达或者其他操作。
聚合美超保真酶技术经过多年的打磨升级，已经完全能胜任无缝克隆需求，升级款MF018-plus里头就配备了聚合美最具特色的“长又亮”Neo超保真酶，确保连接成功的同时不引入新的突变，让您实验顺心放心！
三 限时秒杀，长片段无缝克隆实验做起来！
神器在手，克隆我有！5x高浓缩 mix 限时秒杀价249元/10T,那些半路折戟的长片段连接赶紧做起来!
聚合美无缝克隆系列产品六折优惠(即日起至：2021年11月30日)。欢迎大家咨询订购，申请试用装，欢迎小伙伴们添加聚合美官方微信，为您解决实验中碰到的各种问题。
温馨提示：（注意以下细节，克隆少走弯路）
请仔细阅读产品说明书，严格按照说明书操作。
制备载体及目的片段时，一定要纯化后通过DNA电泳对比条带亮度进行定量，仅靠OD值是不够的（因为某些时候OD值可能虚高）。载体和模板浓度过小时(1ul。
体系混匀后37℃反应15-30分钟即可，如果同源臂GC含量高，可以提高到50-55 ℃。建议在PCR仪器上进行，水浴锅等常规仪器对温度控制不精确（尤其37℃），影响重组效率。
进行阳性对照反应，排除其他实验材料及操作因素的影响。
重组产物加入的量不要超过感受态体积的1/10，如果转化子较少，可以将所有的产物转化并将所有的转化液涂板。涂板时建议将菌液离心富集，保留100μl重悬、涂板。
无缝克隆和同源重组的区别
没有区别。根据查询无缝克隆和同源重组的相关资料得知，无缝克隆和同源重组是没有区别的。1、无缝克隆又叫同源重组，它可以将单个至多个片段同时插入到一个载体中，而不需要进行多次的酶切和纯化。通常情况下，无缝克隆可以在 5-15 min内完成多个片段的连接，其克隆阳性率高达 98% 以上。2、我们在无缝克隆前进行 PCR 扩增的时候，载体与片段之间、片段与片段之间需有 15-20 碱基的一段同源序列，这是为什么呢？因为我们无缝克隆的试剂盒里面存在三种酶，分别是 T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶。其中 T5 核酸外切酶具有 5’-3’核酸外切酶的活性，能够将序列从 5’-3’开始降解，此时暴露出载体以及片段的3’同源序列，经过碱基互补配对，DNA 聚合酶添加缺失碱基后由 DNA 连接酶将片段与载体进行连接，从而达到载体重组的功能。因此，如果不添加同源序列，载体与片段、片段与片段之间将无法进行连接。
无缝克隆试剂盒常见问题与处理办法
一、平板上无克隆或克隆数目很少1、可能的原因：引物序列不正确
解决方案：确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。
2、可能的原因：PCR产物不纯
解决方案：优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物；换一种纯化方法，纯化您的PCR产物。
3、可能的原因：反应体系中DNA浓度太低
解决方案：在重组反应中，加入推荐的DNA量。
4、可能的原因：不纯的载体或插入片段抑制重组反应
解决方案：推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。
5、可能的原因：转化过程中加入重组反应液过多
解决方案：重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。
6、可能的原因：感受态细胞转化效率低
解决方案：更换新鲜、高效的感受态细胞。
7、可能的原因：培养基中加入错误或过多抗生素
解决方案：在转化平板中加入正确、适量的抗生素。
二、假阳性克隆数目多
1、可能的原因：克隆载体线性化不完全
解决方案：重新酶切您的载体，增加酶切时间，并胶回收纯化。
2、可能的原因：PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染
解决方案：可在PCR反应之前先将模板质粒线性化；PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。
3、可能的原因：转化用平板放置时间过长导致抗性失效
解决方案：确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。
三、克隆含有不正确的插入片段
可能的原因：PCR产物混有非特异性片段
解决方案：优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段。
inyoep@